目前晚期胆道癌 (BTC) 的标准治疗方案是吉西他滨、顺铂加抗 PD1/PD-L1，但反应率不高。本研究旨在探索 durvalumab（抗 PD-L1）和 tremelimumab曲美木单抗（抗 CTLA-4）在晚期 BTC 中联合和不联合介入放射学 (IR) 治疗的疗效和安全性。

符合条件的晚期 BTC 患者，如果之前接受过或拒绝过至少一线全身治疗，则接受 tremelimumab 和 durvalumab 联合治疗，共四次，然后每月单独使用 durvalumab，有时进行 IR 手术，直至病情进展或出现不可接受的毒性。每 8 周通过 CT 或 MRI 评估一次客观反应，根据实体肿瘤反应评估标准 (RECIST，版本 1.1)。记录和管理不良事件 (AE)。主要终点是 6 个月无进展生存期 (PFS)

共招募了 23 名晚期 BTC 患者；17 名患者接受 durvalumab 和 tremelimumab (Durva/Treme) 治疗；6 名患者接受 durvalumab、tremelimumab 加 IR 手术 (Durva/Treme + IR) 联合治疗。Durva/Treme 组的 佳临床反应为部分反应 (n=1)、病情稳定 (n=5)、病情进展 (n=5)，而 Durva/Treme + IR 组的 佳临床反应为部分反应 (n=0)、病情稳定 (n=3)、病情进展 (n=3)。Durva/Treme 组的中位 PFS 为 2.2 个月（95% CI：1.3–3.1 个月），Durva/Treme + IR 组的中位 PFS 为 2.9 个月（95% CI：1.9–4.7 个月）（p=0.27）。Durva/Treme 组的中位 OS 为 5.1 个月（95% CI：2.5–6.9 个月），而 Durva/Treme + IR 组的中位 OS 为 5.8 个月（95% CI：2.9–40.1 个月）（p=0.31）。大多数 AE 为 1-2 级。

Durva/Treme 和 Durva/Treme + IR 显示出相似的疗效。具有可控的安全性。需要进行更大规模的研究才能充分表征 Durva/Treme ± IR 在晚期 BTC 中的疗效。

1 引言

胆道癌 (BTC) 是一种罕见但具有侵袭性的恶性肿瘤，起源于胆管、胆囊和肝脏内壁上皮细胞。手术切除或肝移植可治愈早期患者，但大多数患者会复发或 初表现为晚期疾病。转移性BTC的预后通常较差，5 年相对生存率仅为 2%–5%。这种低生存率部分是由于 BTC 患者缺乏有效的治疗选择，但随着对 BTC 生物学理解和下一代基因测序等技术的 新进展，晚期 BTC 的新型潜在治疗方法不断涌现。

ICI 靶向细胞毒性 T 淋巴细胞相关蛋白 4 (CTLA-4) 和程序性死亡配体 1 (PD-1/PD-L1) 途径，彻底改变了几种实体瘤的治疗方法。与其他实体瘤一样，BTC 会引发并逃避有效的免疫反应。抑制免疫检查点蛋白使细胞有机会引发强烈的免疫反应，并允许 T 细胞杀死癌细胞。ICI 单药治疗在 BTC 中显示出有限的总体反应率 (ORR)，但ICI 联合全身治疗（例如与吉西他滨和顺铂的联合化疗）已被证明可以改善总体生存率 (OS)。虽然这种联合化疗 + ICI现在是一线治疗的标准治疗方法，但反应率仍然不高，并且反应持续时间通常很短。

肿瘤突变负荷 (TMB) 是每百万个 DNA 碱基中非遗传突变的总数，可用作患者对免疫疗法反应的预测生物标志物。一般而言，TMB 越高，肿瘤组织与正常组织之间的差异越大，对免疫疗法的反应越好。对于在一线治疗中进展的患者，可以根据肿瘤基因组学采用精准医疗。据估计，约 40% 的 BTC 患者至少携带一种可靶向的致癌基因改变，包括IDH1/2、FGFR2、KRAS、BRAF、ERBB2、NTRK、ROS、RET和其他编码错配修复酶的基因的变化。一些此类致癌驱动因素的选择性抑制剂已被证明可以改善无进展生存期 (PFS)、OS 和 ORR，然而据报道，不同 BTC 亚型对精准医疗治疗方案的反应存在很大差异，并且获得性耐药几乎无处不在。对于没有可靶向致癌突变的患者，使用氟吡啶类化疗组合治疗（通过干扰 DNA 合成起作用的化合物）可获得适度改善。

介入放射学 (IR) 技术，如冷冻消融 (CRYO) 和射频消融 (RFA)，正在成为治疗 BTC 的有前途的局部疗法。多项研究报告了这些技术在控制局部疾病和改善晚期 BTC 患者生存结果方面的有效性。研究表明，冷冻和射频消融在缓解胆道阻塞方面是安全有效的，我们和其他人已经表明，它们可以与化疗或免疫疗法等其他疗法结合使用，为某些患者带来更好的结果。需要进一步研究以探索这些联合疗法在 BTC 管理中的全部潜力。

我们 初测试了 tremelimumab 联合微波消融治疗难治性 BTC。这项试验是基于我们在接受 tremelimumab 联合局部区域疗法治疗的肝细胞癌患者中观察到的积极结果而发起的。本研究的目的是研究 tremelimumab 加 durvalumab 联合治疗晚期 BTC 患者的安全性和有效性，并确定在联合 ICI 疗法（tremelimumab 和 durvalumab）中添加 IR 是否可以改善晚期 BTC 患者的预后，因为 tremelimumab 单药治疗对 BTC 的影响极小。研究设计包括两组在接受一线治疗后病情进展的晚期 BTC 患者。队列 1 接受了 durvalumab 和 tremelimumab 治疗，而队列 2 接受了相同的组合以及 IR 手术。主要终点是 PFS。还分析了 OS、ORR 和安全性。

2 材料和方法

2.1 患者

符合条件的患者至少年满 18 岁，并由美国国家癌症研究所 (NCI) 病理实验室对 BTC 进行组织病理学确认。患者必须患有无法进行潜在治愈性切除、移植或消融的疾病。患者必须在晚期情况下接受、不耐受或拒绝至少一线化疗。所需的 ECOG 体能状态为 0-2，器官和骨髓功能正常是纳入标准。慢性自身免疫或炎症性肠病病史被视为排除标准。所有患者均提供了书面知情同意书，并且该研究得到了 NCI 机构审查委员会的批准。所有病例均在 NCI 多学科胃肠道肿瘤委员会上进行了讨论。ClinicalTrials.gov标识符为 NCT02821754 。

2.2 研究设计

符合资格标准的患者被纳入研究。所有患者每 4 周接受一次 1500 mg 度伐单抗静脉注射和 75 mg tremelimumab 静脉注射，共 4 个周期，随后每月每 4 周单独接受 1500 mg 度伐单抗静脉注射，直至病情进展或不耐受。第 1 组的患者仅接受药物治疗。第 2 组的患者接受药物治疗，并在第 36 天另外接受 IR 手术。每 8 周进行一次增强 CT 或 MRI 扫描进行影像学研究。通过实体肿瘤疗效评价标准 (RECIST，版本 1.1) 评估客观疗效。在基线、 次 ICI 给药前和第 36 天（第二次 ICI 给药后）进行肿瘤活检。主要目标是评估晚期 BTC 患者联合使用 tremelimumab 和度伐单抗（联合或不联合 IR）的 6 个月 PFS。次要目标是评估在 BTC 患者中联合使用 tremelimumab 和 durvalumab（有或无 IR）的安全性和可行性。微波消融仅对那些因肿瘤大小有限而被认为对患者有益的患者进行。我们还观察了肿瘤大小的变化。安全性和毒性进行了监测和管理。

2.3 安全性和有效性

根据 NCI 不良事件通用术语标准 v 4.0 报告了 后一次给药后 30 天内发生的所有不良事件 (AE) 和严重 AE。所有患者从首次接受 tremelimumab 和 durvalumab 治疗时起即可评估毒性。可评估人群定义为所有接受过至少一个疗程治疗并使用 RECIST 1.1 重新评估影像学疾病的患者。此外，PFS 和 OS 采用 Kaplan-Meier 方法计算，并以中位数、比率和 95% CI 报告。

2.4 基因表达分析

采集了基线活检和治疗期间活检样本。肿瘤样本在深度冷冻条件下新鲜冷冻保存。提取、测序和分析 DNA 和 RNA，如前所述。进行全外显子序列分析样本和 TMB 的特定突变。进行 RNA 测序分析以检查基因表达。对于免疫亚型分类，使用已发布的基因列表通过 GSVA 分析计算每类基线样本的富集分数。使用CIBERSORTx作为反卷积方法根据免疫亚型对样本进行比对。使用 RSEM 输出的 TPM 基因表达矩阵，并使用 LM22 作为基因特征矩阵，如前所述。

2.4.1 批量 RNA 测序和数据分析

按照之前的方法，在基线和治疗后从新鲜冷冻的针吸活检肿瘤样本中提取 RNA。使用Illumina 的 NEBNext® Ultra™ II 定向 RNA 文库制备试剂盒制备文库，根据 CCR 测序中心的 RNA 可用性采用 100 ng或 5 ng 方案。含有 <5 ng RNA（“低浓度”）的样本使用 5 ng 方案制备。测序数据由 CCR 测序中心生成。99 个样本在 NovaSeq S2 流动槽（2 × 151 bp）上进行测序；72 个产量良好的样本然后在 NovaSeq S4 流动槽（2 × 151 bp）上进行更深度测序，然后合并读数。简而言之，使用 bbtools 版本 38.87 修剪 fastq 格式的序列。使用STAR 2.7.6a 使用 gencode.v36.annotation.gtf 和 hg38 Ref.对修剪后的序列进行比对。使用 RSEM 版本 1.3.0 量化比对数据以生成二维（基因×样本）基因计数矩阵。

2.4.2 肿瘤分析

下游分析和可视化是在 NIH 综合分析平台 (NIDAP) 中使用在 Foundry 平台 (Palantir Technologies) 上开发的 R 程序进行的。将基因计数矩阵导入 NIDAP 平台，在那里过滤低计数 (<1 cpm) 的基因，并使用 limma 包通过分位数标准化进行标准化。使用基因集变异分析 (GSVA) 进一步分析标准化数据。此外，执行 CIBERSORTx 以估计大量样本中免疫细胞的比例，如前所述。RSEM输出的 TPM 基因表达矩阵被重新格式化为仅包含基因符号。使用 CIBERSORTx 34和 LM22 特征矩阵在 模式下通过批次校正对免疫浸润进行分析。每种细胞类型的相对丰度计算为 分数的比例。对 CIBERSORT 免疫细胞类型比例的统计分析表明，处理样本和对照样本之间所有不同细胞类型之间没有显着性。除一个原发性肝样本外，其余样本的p值均 <0.05（n=200）。

2.4.3 统计分析

该试验 初设计为招募 多 7 个单独的小队列，每个队列 多招募 10 名患者，进行按疾病类型和治疗方法区分的初步评估，旨在了解是否可以改善历史比例稳定在 10%–15%。但是，为简单起见，并根据实际观察到的入组患者类型，本文中的队列仅指所施用的广泛治疗类别之间的区别，本次评估结合了多种疾病类型。使用 SAS 9.4 版和 GraphPad Prism9 软件进行统计分析。OS 是从研究日期到死亡日期计算的。PFS 是从研究日期到进展日期计算的，如果继续参与研究的患者在进展前死亡，则从死亡日期计算。OS 和 PFS 的概率通过 Kaplan-Meier 方法计算，两个 Kaplan-Meier 曲线之间差异的统计显着性通过对数秩检验确定。

3 结果

3.1 患者特征

这项研究招募了 25 名 BTC 患者，其中包括 20 名肝内胆管癌 (iCCA) 患者、1 名肝外胆管癌 (eCCA) 患者和 2 名胆囊癌患者。这些患者均未接受过免疫检查点抑制剂治疗。注册后，有两名患者选择不继续参加试验，也从未接受过治疗。其余 23 名患者的中位年龄为 63 岁（范围：21-80 岁）。患者被注册到两个队列之一。队列 1 仅接受 durvalumab 和 tremelimumab（Durva/Treme）治疗，队列 2 接受 Durva/Treme 治疗并接受 IR 手术（Durva/Treme + IR）。队列 1 中 82% 的患者和队列 2 中 100% 的患者出现肝外转移。两个队列中 100% 的患者均接受过既往治疗，包括化疗（两个队列均为 100%）、放疗（队列 1 为 29%，队列 2 为 33%）和/或手术切除（队列 1 为 41%，队列 2 为 83%）。两个队列患者的所有基线特征均列于表 1中。

队列 1 (n=17) 中的患者接受静脉注射 (IV) 1500 mg durvalumab 和每 4 周静脉注射 75 mg tremelimumab 治疗，共四个周期，随后每月单独静脉注射 1500 mg durvalumab，直至病情进展或出现不可接受的毒性。队列 2 (n=6) 中的患者接受与队列 1 相同的治疗方案，并在第 36 天额外接受 IR 手术。

3.2 疗效

队列 1 和队列 2 的研究中位随访期分别为 5.1 个月和 5.8 个月（图3A）。队列 1 中的 11 名患者和队列 2 中的 6 名患者的病变可通过肿瘤大小变化来评估疗效。两组患者中，有一例患者出现部分缓解，ORR 为 4%。部分缓解持续约 4 个月。8 名患者病情稳定，疾病控制率为 30%。8 名患者在治疗后病情继续恶化。

计算了队列 1 中的 17 名患者和队列 2 中的 6 名患者的 PFS 和 OS。队列 1 的中位 PFS 为 2.2 个月（95% CI：1.3-3.1 个月），队列 2 的中位 PFS 为 2.9 个月（95% CI：1.9-4.7 个月）（p=0.27），两个队列合计的中位 PFS 为 2.2 个月（95% CI：1.9-3.4 个月）。所有接受完全治疗的患者在 6 个月内均出现疾病进展；一名接受一剂治疗的患者因不依从而在 3 周后在 PFS 曲线中被删除；由于给予的治疗量很少，因此将这名患者纳入其中。队列 1 的中位 OS 为 5.1 个月（95% CI：2.5–6.9 个月），队列 2 的中位 OS 为 5.8 个月（95% CI：2.9–40.1 个月）（p=0.31），两个队列合计的中位 OS 为 5.6 个月（95% CI：3.8–6.3 个月）。由于患者数量较少，未进行疾病特异性亚组分析。

3.3 安全性

共报告了 113 起治疗相关 AE。所有患者均出现至少一起治疗相关 AE，其中大多数为 1-2 级（58%），不需要医疗干预。52% 的患者出现 3 级 AE，其中大多数为实验室发现，包括淋巴细胞减少、ALT、碱性磷酸酶或 AST 升高。没有 4 级 AE，只有 1 起 5 级 AE；重症肌无力（通过类固醇和免疫球蛋白治疗得到缓解）。 常见的治疗相关 AE 是淋巴细胞减少、AST 升高、瘙痒、疲劳和贫血。八名患者出现免疫相关 AE；没有因 AE 而死亡的病例。

3.4 相关研究

我们探究了基线和治疗时活检样本的 TMB 和免疫细胞组成。具体突变如图5A所示 。所有样本的活检 TMB 均低于每 Mb 编码区 15 个非同义突变，TMB 相对较低。分析了基线和治疗时活检样本的免疫细胞组成。仅在一份（总共八份）活检样本中观察到 CD8 + T 细胞明显增加，且该患者在接受免疫检查点抑制剂治疗后病情出现进展。未观察到免疫检查点抑制剂治疗后的其他明显变化。

作为一项探索性试验终点，通过分析 15 名患者（其中 8 名患者在基线和治疗时（第 36 天）的肿瘤样本）的肿瘤活检样本，研究了药效学作用和潜在的潜在免疫机制。对肿瘤活检样本进行了批量 RNA 测序分析。所有测试样本的 TMB（每 Mb 编码区非静默突变数，35.7 Mb）没有显著差异，突变谱与我们在早期研究中看到的相似。使用 Martin-Serrano 等人的基质、肿瘤和免疫微环境 (STIM) 分类器对基因表达数据进行基因集变异分析。表明，所有五种先前描述的 ICC 免疫亚型都存在。“免疫经典”亚型是 常见的亚型经过筛选仅显示冷冻样本，使其成为 12 名患者中 5 名的主要特征。使用 CIBERSORTx 反卷积工具，我们能够对免疫浸润进行分析，结果显示治疗后和基线样本之间测量的任何免疫细胞类型的比例均没有显著差异。

4 讨论

本研究旨在评估 durvalumab 和 tremelimumab 在先前接受过至少一线全身治疗的晚期 BTC 患者中联合和不联合 IR 的安全性和有效性。本研究基于以下假设：联合 IR 与 ICI 可选择性增强抗肿瘤免疫力，从而改善 PFS 和OS。

该研究分析了 23 名晚期 BTC 患者，主要终点为 6 个月 PFS。结果显示，Durva/Treme 和 Durva/Treme + IR 均耐受性良好，且不良反应可控。大多数不良反应为 1-2 级，只有一名患者出现 5 级不良反应：重症肌无力，通过药物治疗得到缓解。两组患者的安全性相似，表明 IR 与 ICI 联合使用不会导致晚期 BTC 患者出现过度毒性。

从历史上看，单药 ICI 联合微波消融的中位 PFS 为 3.4 个月，OS 为 6 个月。在我们目前的研究中，两个队列的疾病控制率合计为 30%。 佳临床反应是 Durva/Treme + IR 队列（三名患者）病情稳定，而 Durva/Treme 队列（一名患者）病情部分缓解。两个队列的中位 PFS 和 OS 分别在 2-3 个月和 5-6 个月时相似。这些结果与之前的报告相似；然而，该研究未显示 Durva/Treme + IR 和单独使用 Durva/Treme 之间的疗效有任何显著差异，并且没有患者能够在研究中坚持 6 个月而不出现进展。

对基线和治疗期间活检样本的分子分析显示，TMB 较低，治疗后免疫细胞组成变化很小。作为免疫疗法反应的已知生物标志物，低 TMB 正确预测了该人群的反应不佳。然而，鉴于样本量小、临床反应各异以及已知的个体间差异，在这项小型研究中，不太可能根据治疗反应或临床结果一致地识别免疫细胞变化。

由于尚不清楚的原因，ICI 疗法对 BTC 的反应并不像对 HCC 那样乐观。在我们之前的研究中，对接受 tremelimumab 和消融治疗的患者样本的免疫分析显示 HCC 和 BTC 细胞之间免疫细胞亚群变化模式存在差异。尽管HCC 和 BTC 都源自肝脏，但不同的肿瘤发生途径、BTC 与 HCC 独特的肿瘤免疫反应和/或 BTC 的低突变负担可能发挥了作用。

两种治疗方案之间缺乏疗效差异可能是由于研究人群由已接受过至少一线全身治疗的难治性疾病患者组成。这可能表明，当肿瘤负担较低且免疫系统未因先前治疗而受到严重损害时，Durva/Treme 联合治疗在一线治疗中可能更有效。之前一项研究支持了这种可能性，该研究使用 Durva/Treme 作为肝细胞癌患者的一线治疗，中位 OS 约为 16 个月。先前的研究还发现，在 ICI 中添加化疗可改善结果，未来的研究可以评估这三种药物的组合：ICI、化疗和 IR。本研究中两个队列的 PFS 和 OS 率相似的其他可能原因可能与 IR 的使用有关。虽然 IR 是治疗肝肿瘤的常用方法，但它可能并非对所有 BTC 患者都有效，或者对某些患者的效果可能优于其他患者。Durva/Treme + IR 组患者的肿瘤可能对此类治疗没有反应，这可能会影响联合治疗的整体疗效。

本研究的局限性包括样本量小和 BTC 的异质性。本研究中的患者基线疾病状态和原发肿瘤位置不同。未来在大型随机研究中对联合治疗的评估应考虑这些因素。

5 结论

虽然我们没有发现两组之间的疗效指标有任何显著差异，但两组的安全性是可控的，且相似。这一发现可以为考虑在晚期 BTC 患者中联合使用 ICI 和 IR 的临床医生提供保障。鉴于可评估的研究人群规模较小，对结果的解释有限。durvalumab 和 tremelimumab 联合使用或不联合 IR 都是安全的，需要进行更大规模的研究才能充分评估疗效。